wg Koehlera

---

Przysłona irysowa przy kondensorze nie służy do regulowania jasności obrazu.

Oświetlenie w mikroskopie musi być ustawione w systemie Koehlar dla zapewnienia najlepszej warunków dla oglądania preparatu. Umożliwia ono uzyskanie równego oświetlenia całego pola widzia, z minimalizacją świetła rozproszonego, obniżającego kontrast. W mikroskopie z oświetleniem ustawionym wg Koehlara można sterować rozdzielczością obrazu, jego kontrastem i głębią ostrości.

Procedura ustawiania

Dla wykonania procedury konieczna jest wiedza o elementach budowy i ustawienia mikroskopu. Przed (lub przy) pierwszym przejściu przez procedurę należy korzystać z szerszych wyjaśnień podanych w odsyłaczach.

Ustawienie oświetlenia wg Koehlera można wykonać jedynie w mikroskopie wyposażonym w odpowiednie ku temu elementy. Mikroskop nie może mieć uproszczonego układem oświetlającego. Uproszczone mikroskopy mają zwykle wbudowany oświetlacz ale bez przysłony polowej, często mają na drodze promieni oświetlających niewyjmowalną matówką. Konstrukcje takie są typowe dla mikroskopów studenckich (np. PZO Studar) i dla tanich modeli mikroskopów. Podobna sytuacja występuje też w mikroskopach z zewnętrznym oświetlaczem (w podstawie mają lusterko) ale nie skompletowanych z lampą mikroskopową, z odpowiednią żarówką i wyposażoną w kolektor i przysłonę polową. Tym niemniej, jeśli uproszczony mikroskop posiada kondensor z przysłoną irysową, możliwe jest w znacznym stopniu sub-optymalne sterowanie najważniejszym parametrem - aperturą.

Po kilku, kilkunastu powtórzeniach wykonanie tej procedury zajmuje kilkanaście sekund i robione jest całkowiecie automatycznie, nawet po obudzeniu w środku nocy. I o to chodzi :)

Krok 1. Ogniskowanie preparatu

a. Ustawiamy obiektyw o małym powiększeniu (najlepiej x10).
b. Kładziemy preparat na stoliku, zgrubnie ustawiamy szkiełko względem obiektywu w miejscu gdzie "coś możę być".
c. Ogniskujemy śrubą makro i znajdujemy miejsce preparatu gdzie "coś jest".
d. Ogniskujemy śrubą mikro ostry obraz. W polu widzenie nie może być gęsto - jeśli za dużo "się dzieje" odjechać z tym na bok.

Krok 2. Ustawienie przysłony polowej

przysłona polowa zogniskowana i wycentrowana

W tym kroku efektem regulacji jest minimalizacja światła rozproszonego i zwiększenie kontrastu obrazu.

Obserwację prowadzimy przez okular mikroskopu.

a. Przymykamy silnie przysłonę polową.
b. Ogniskujemy (posuwem góra-dół kondensora) ostry obraz jej krawędzi w polu wiedzenia..
c. Centrujemy w polu widzenia obraz przysłony polowej.
d. Otwieramy przysłonę polową tak, aby było odsłonięte całe (lub niemal całe) pole widzenia.

Krok 3. Ustawienie przysłony aperturowej

źródło światła ostre i centralne w odpowiednio przymkniętej przysłonie aperturowej

W tym kroku sterujemy parametrami: rozdzielczość optyczna obrazu versus kontrast i głębia ostrości.

Obserwację prowadzimy w źrenicę wyjściową obiektywu - są różne metody obserwacji źrenicy wyjściowej obiektywu. Zawsze na podorędziu jest ta najprostsza - wyjąć okular i zajrzeć wgłąb tubusu jednym okiem, ustawionym w osi optycznej tulei okularu. Jeśli mamy taką możliwość zmniejszamy jasność żarówki do minimum - ułatwi to obserwację.

a. Ustawiamy równomiernie oświetlenie źrenicy.
b. Ustawiamy wielkość przysłony aperturowej - przymykamy aż do ukazania się jej brzegu i nastęnie przymykamy tak aby 2/3 źrenicy wyjściowej obiektywu było odsłonięte. Przy obserwacji bardzo drobnych detali (np. urzeźbienie zarodników) otwieramy do 90%.

Krok 4. Gotowe

a. Wracamy do obserwacji obiektu przez okular.
b. Możemy jeszcze raz skorygować ogniskowanie obrazu preparatu i ogniskowanie oraz wielkość obrazu przysłony polowej.

Po zmianie obiektywu

Dla każdego obiektywu rozmiar przysłony polowej i jej ogniskowanie oraz rozmiar przysłony aperturowej jest inny. Dlatego po zmianie powiększenia na inne musimy skorygowac te ustawienia. Poniżej podano kierunek zmian przy zmianie powiększenia z mniejszego na wyższe. Kierunek zmian przy "zchodzeniu w dół z powiększeniem" będzie odwrotny.

a. Zmniejszamy (bo mniejsze pole widzenia przy większym powiększeniu) przysłonę polową tak aby jej krawędz ukazała się w polu wiedznia. Korygujemy jej ogniskowanie i wycentrowanie.
b. Obserwując źrenicę wyjściową obiektywu zwiększamy stosownie przysłonę aperturową (bo apertura obiektywu jest większa).
c. Zwykle nie ma potrzeby poprawiania ustawienia żarnika żarówki. Różnice dla poszczególnych obiektywów są niewielkie i to ustawienie nie jest zbyt istotne.

Po nabraniu wprawy i biegłości przy ustawianiu oświetlenie wg Koehlara ściśle wg przedstawione procedury, będziemy mogli pójść na pewne uproszczenia. W szczególności, przy zgrubnie ustawionym mikroskopie po wcześniejszych operacjach, daje się też nastawiać oświetlenie bezpośrednio na silnie powiększającym obiektywie nieimersyjnym (zwykle jest to x40). W razie problemów z nastawieniem: trudność ze zogniskowanem obrazu przysłony polowej, trudności z wprowadzeniem obrazu żarnika do światła przysłony aperturowej, należy wrócić do ustawień na słabo powiększającym obiektywie (×10).

Uwagi. Problemy i przypadki szczególne.

Kiedy się nie da ustawić oświetlenia wg Koehlera

Mikroskop ma uproszczona konstrukcję jak to wyjaśniono na początku tego artykułu.

Żarówka jest nieodpowiednia: za krótka, zbyt duża odległość żarnika od końca bańki żarówki, silnie zdecentrowany żarnik i brak możliwości regulacji. W szczególności należy ściśle używać modeli żarówek przeznaczonych dla danego mikroskopu.

Nie daje się ustawić oświetlenia wg Koehlara (wg opisanej wyżej procedury) dla obiektywów o powiększeniu mniejszym niż ×10. Dla obiektywów o bardzo małym powiększeniu stosuje się inny system ustawienia oświetlenia i zmienia kondensor lub nie stosuje oświetlenia wg Koehlera.

Jeśli startuje się do ustawiania ze skrajnie rozregulowanej pozycji i na mało kontrastowym (bezbarwnym) preparacie może być problem z realizacją kroku pierwszego tj. zogniskowaniem obrazu preparatu. Należy wtedy podnieść kondensor na ok. 2 mm pod szkiełkiem przykrywkowym, zmniejszyć przysłonę aperturową i polową oraz nastawić aby-aby ostrość obrazu. Po wykonaniu kroku 2 i 3 będzie możliwe dokładne zogniskowanie obrazu preparatu, czyli wykonanie kroku 1. Potem wystarczy korekta ustawień przysłon jak opisane w krokach 2 i 3.

Jeśli w polu widzenia jest za dużo "treści" to obraz przesłony aperturowej i żarnika (Krok 3) może być mniej lub bardziej nieostry (do nieczytelności włącznie). Należy tak przesuną preparat aby pole widzenia było stosunkowo przejrzyste, bez nadmiernej liczby obiektów.

Jeśli w bieg promieni jest włączona matówka, zmatowiona soczewka rozpraszająca (np. w kondesorach PZO jest uchylna, zmontowana soczewka pod kondensorem) lub jest zmatowiona bańka żarówki, to możemy nie uzyskać obrazu przysłon i żarnika. Należy z biegu promieni wyłaczyć matówki i/lub zmatowioną soczewkę rozpraszającą. Przy obserwacji z oświetleniem wg Koehlara nie należy włączać w bieg promieni matowych elementów gdyż niszczy to prawidłowe ustawienia tego systemu.

Uwagi o ogniskowaniu obrazu przysłony polowej

przysłona polowa nieostra, wycentrowana

Trzeba pamiętać o przymknięciu przyłony polowej przed operacją ogniskowania. Inaczej obraz jej krawędzi może znajdować się poza polem widzenia. Nie ma wtedy możliwości kontroli jej ogniskowania (i centrowania)

Obraz przysłony polowej ogniskuje się posuwem góra-dół kondensora. Kondensor znajdzie się stosunkowo blisko szkiełka przedmiotowego. To że jesteśmy w pobliżu optimum stwierdzimy po wzroście jasności obrazu i jej równomiernym rozłożeniu. W mikroskopach zwykle jest (regulowana) blokada posuwu kondensora w górę. Jeśli jest zbyt wcześnie ustawiona to możemy nie zogniskować obrazu przysłony polowej. Jeśli jest zbyt daleko umieszczona to można wjechać kondensorem w preparat. W efekcie ryzykujemy uszkodzenie preparatu i/lub górnej soczewki kondenora i/lub czołowej soczewki obiektywu.

Przy wyższych powiększeniach obraz przysłony polowej będzie coraz bardziej zamglony, mniej kontrastowy. Jest to związane z brakami w korekcji aberacji optycznych kondesora. Szczególnie to dotyczy zwykłych kondensorów Abbego. Z tego samego powodu obraz krawędzi jest nieco rozmyty i przy przechodzeniu przez optimum występuje wokół krawędzi silna barwna obwódka.

To czy odsłaniać całe pole widzenia, czy pozostawiać jej krawędz w polu widzenia, to kwestia gustu i potrzeb. Ja lubię pozostawić w polu widzenia - pozwala to na kontrolę stopnia ogniskowania i pewność że przysłona polowa nie jest nadmiernie rozwarta.

Uwagi o centrowaniu obrazu przysłony polowej

przysłona polowa przymknięta, ostra, niewycentrowana, obj. x40

przymknieta, ostra, zdecentrowana, obj. x10

Obraz przysłony polowej centruje się posuwem kondesora w płaszczyźnie prostopadłej do osi otycznej. Zwykle są to dwa pokrętła w obejmie kondensora (np. PZO Biolar). W wielu mikroskopach nie ma możliwości centrowania kondensora.

Metody obserwacji źrenicy wyjściowej obiektywu

Istnieje wiele prostych sposobów obserwacji źrenicy wyjściowej obiektywu. Różnią się one między soba jedynie stopniem komfortu. Dla większej wygody obserwacji (bo jest duży kontrast jasności) należy zredukować jasność żarówki do minimum przez obniżenie napięcia zasilania lub użycie niematowych filtrów pochłaniających część światła.

źrenica wyjściowa obiektywu oglądana po wyjęciu okularu; oko obserwatora ustawione niezbyt osiowo

Metoda najprostsza nie wymaga żadnych dodatkowych przyrządów. Wyjmuje się jeden z okularów i patrzy wgłąb tubusa jednym okiem ustawionym w osi optycznej mikroskopu.

Zaletą tej metody jest szybkość. Wadą to, że przy dużych powiększeniach obiektywu obraz źrenicy jest stosunkowo mały przez co kłopotliwy w obserwacji. Zchodzenie oka z osi optycznej utrudnia precyzyjne ustawienie centrowania żarnika.

Utrzymaniu oka w osi optycznej pomaga wstawienie w miejsce okularu krążka z niewielkim centralnym otworem.

prawidłowo ustawiony obraz źrenicy wyjściowej obiektywu obserwowany przez mikroskop pomocniczy

Metodą najbardziej godną polecenia jest użycie mikroskopu pomocniczego. Przyrząd ten jest np. standardowo dodawany do zestawów kontrastu fazowego. Ma formę zwykłego okularu, z tym że górny element jest przesuwany. Mikroskop pomocniczy wkłada się w miejsce okularu i przesuwem górnego elementu nastawia ostry obraz źrenicy wyjściowej. Obraz jest powiększony i obserwujemy go w osi optycznej przez co komfort obserwacji i precyzja są większe.

Są mikroskopy (z wyższej półki, badawcze) z włączaną w tubus soczewką Bertranda. Po jej właczeniu w okularach widać źrenicę wyjściową obiektywu.

Centrowanie żarnika

przyslona aperturowa ustawiona poprawnie ale obraz żarnika nieostry

przyslona aperturowa ustawiona poprawnie ale żarnik zdecentrowany

Jeśli w źrenicy wyjściowej obiektywu nie widzimy krążka równomiernie wypełnionego ostrym obrazem włókna żarówki to ustawiamy centrowanie żarówki i ostry obraz jej żarnika (o ile mikroskop pozwala na taką regulację. W PZO Biolar z oświetlaczem żarowym nieco posuwa w osi optycznej oprawę żarówki w prowadnicy i pochyla wewnętrzny element oprawy w płaszczyźnie prostopadałej do osi optycznej.

Optymalna wielkość apertury zależy ...

przyslona aperturowa rozwarta poza granice apertury obiektywu

Optymalna dla danej obserwacji wielkość apertury zależy od rodzaju obserwowanych obiektów. Gdy interesuje nas kształt dużych komórek to korzystniejsza jest mniejsza apertura, 2/3 do 1/2. Gdy potrzebujemy oglądać detale na granicy rozdzielczości optycznej to stosujemy aperturę oświetlenia bliską aperturze obiektywu (90%).

Wraz z powiększaniem światła przysłony aperturowej rośnie rozdzielczość ale maleje kontrast i głębia ostrości. Powiększanie przyslony aperturowej ponad aperturę obiektywu jest wyłącznie szkodliwe - zwiększa ilość światła rozproszonego - zmniejsza kontrast obrazu.

Wraz ze zmniejszaniem światła przysłony aperturowej maleje rozdzielczość ale rośnie kontrast i głębia ostrości. Przy zmniejszaniu poniżej 2/3 apertury obiektywu konstrast jest coraz bardziej przerysowany i narastają dyfrakcyjne błędy odwzorowania.

Jeśli jest taka możliwość centrujemy obraz przysłony aperturowej. Nieczęsto konstrukcja mikroskopu pozwala na jakiekolwiek centrowanie; w standardowym kondensorze PZO Biolar można przesuwać przysłonę kondensora nieco po łuku prostopadle do osi optycznej).

Dla obiektywów o dużej aperturze kondensor może nie być w stanie wypełnić obrazem źródła świetła całej apertury obiektywu. Inną przyczyną takiego zjawiska może być zbyt mały fizyczny rozmiar żarnika żarówki lub zbyt małe powiększenie układu kolektora-oświetlacza (w przypadku wbudowanych bez szans na prostą zmianę). Wtedy obraz żarnika nie wypełni całej przysłony aperturowej pod kondensorem.

Mikroskop z oświetlaczem i zewnętrzną lampą mikroskopową

Dla mikroskopu z lusterkiem i zewnętrzną lampą mikroskopową procedura ustawiania jest taka sama. W szczególności mamy możliwość znacznego powiększenia obrazu żarnika przez odsunięcie lampy mikroskopowej. Zawsze używamy płaskiej strony lusterka. Służy ona do kierowania śtrumienia światła z lampy, centralnie na przysłonę pod kondensorem. Wklęsła strona lusterka służy wyłącznie do oświetlenia dla słabo powiększających obiektywów, przy wymontowanym kondensorze.

Teoria

Oświetlenie wg Koehlara wymaga określonego wzajemnego ułożenia dwóch przebiegów świetła w mikroskopie: przebiegu oświetlenie i przebiegu światła tworzącego obraz. Musi być taki wzajemne ustawienie odległości: żarnik - kolektor - przysłona polowa - przysłona aperturowa - przedmiot, aby obraz żarnika tworzył się w płaszczyźnie przesłony aperturowej i obraz przysłony polowej tworzył się w przedmiocie. Wielkość przysłony polowej ogranicza się do pola widzenia. Wielkość przysłony aperturowej ogranicza się do części apertury obiektywu. Obraz żarnika centruje się i równomiernie wypełnia nim świetło apertury obiektywu.

Po ustawieniu oświetlenia wg Koehlera pole widzenia jest równomiernie oświetlone, światło rozproszone obniżające kontrast jest zminimalizowane, zdolność rozdzielcza versus kontrast i głębia ostrości jest sterowalna.

Jeśli oświetlenie w mikroskopie jest ustawione w sposób odbiegający od postulatów Koehlera to obserwacja oczami będzie tolerować pewne niedociągnięcia (ale tylko tolerować, obraz i tak będzie mniej szczegółowy i/lub mniej kontrastowy niż mógłby być). Jeśli wykonujemy mikrofotografię, każde uchybienie w oświetleniu jest na zdjęciu widoczne ze zwielokrotnioną siłą. Bez litości.